Strumenti innovativi per la valutazione del rischio da agenti patogeni e da contaminanti ambientali

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STRUMENTI INNOVATIVI PER LA VALUTAZIONE DEL RISCHIO DA AGENTI PATOGENI E DA CONTAMINANTI AMBIENTALI

 

I temi riassunti sotto questa linea tematica appaiono particolarmente importanti e peculiari del DSPMI, in quanto i ricercatori del DSPMI con significativa competenza possono mettere  a punto strumenti innovativi e protocolli  specifici che permettano la valutazione del rischio di infezioni da virus, parassiti e microorganismi colonizzanti gli ambienti ospedalieri ed i cibi.

 

M2.1 APPLICAZIONE DI TEST MOLECOLARI NELLO SCREENING DELL’INFEZIONE CONGENITA DA CITOMEGALOVIRUS

Da quando il Ministero della Salute ha sospeso di supportare l’analisi del Citomegalovirus (CMV) nelle donne in gravidanza, sta emergendo il problema di diagnosticare l’infezione congenita da CMV nei neonati. Infatti, mentre il 10-15% dei neonati infettati congenitamente presenta alla nascita una sintomatologia evidente,  l’85-90% dei neonati infetti non presenta segni clinici. Tuttavia il 5-15% di questi neonati nei primi 2 anni di vita, è a rischio di manifestare complicanze neurologiche come sordità, deficit di sviluppo motorio, ritardo mentale e corioretinite che possono provocare loro disabilità severa ( circa 800/anno).

Nel I° anno di studio, sono stati analizzati  campioni di urine e di sangue per un approfondimento diagnostico nel caso di sospetta infezione da CMV relativo alle seguenti evidenze:

•          Assenza di informazioni sulla sierologia materna

•          Documentata riattivazione in gravidanza

•          Documentata sieroconversione in gravidanza

•          Parto pretermine

•          Rischio di infezione connatale (allattamento)

•          Evidenze cliniche ed ecografiche

Per la rilevazione del genoma di CMV è stato utilizzato un sistema standardizzato di PCR real Time di tipo quantitativo. Sessantasette (18.5%) dei 361 bambini inclusi nello studio sono risultati positivi a CMV  in base alla presenza del DNA virale nei campioni  di urine, in 32 di essi il DNA virale è stato anche evidenziato nel campione ematico. Di particolare interesse è stata l’osservazione che in nessun caso si è testata la presenza del virus nel sangue in assenza di eliminazione urinaria. 

 

M2.1 - Applicazione di test molecolari nello screening dell’infezione congenita da Citomegalovirus

Da quando il Ministero della Salute ha sospeso di supportare l’analisi del Citomegalovirus (CMV) nelle donne in gravidanza, sta emergendo il problema di diagnosticare l’infezione congenita da CMV nei neonati. Infatti, mentre il 10-15% dei neonati infettati congenitamente presenta alla nascita una sintomatologia evidente, l’85-90% dei neonati infetti non presenta segni clinici. Tuttavia il 5-15% di questi neonati nei primi 2 anni di vita, è a rischio di manifestare complicanze neurologiche come sordità, deficit di sviluppo motorio, ritardo mentale e corioretinite che possono provocare loro disabilità severa ( circa 800/anno).

Nel I° anno di studio, sono stati analizzati campioni di urine e di sangue per un approfondimento diagnostico nel caso di sospetta infezione da CMV relativo alle seguenti evidenze (vedi dettagli nella scheda tecnica M2.1):

• Assenza di informazioni sulla sierologia materna

• Documentata riattivazione in gravidanza

• Documentata sieroconversione in gravidanza

• Parto pretermine

• Rischio di infezione connatale (allattamento) 9

 

• Evidenze cliniche ed ecografiche

Per la rilevazione del genoma di CMV è stato utilizzato un sistema standardizzato di PCR real Time di tipo quantitativo. Sessantasette (18.5%) dei 361 bambini inclusi nello studio sono risultati positivi a CMV in base alla presenza del DNA virale nei campioni di urine, in 32 di essi il DNA virale è stato anche evidenziato nel campione ematico. Di particolare interesse è stata l’osservazione che in nessun caso si è testata la presenza del virus nel sangue in assenza di eliminazione urinaria.

P2.1 - Strumenti innovativi per il monitoraggio e sorveglianza entomologica di insetti vettori.

Questa linea di ricerca si propone di mettere a disposizione a soggetti terzi interessati (es. Regione, Comuni, ASL) strumenti innovativi per il monitoraggio e sorveglianza entomologica di insetti vettori di patogeni animali e zoonotici presenti sul territorio nazionale. Le ricerche sono state focalizzate sullo sviluppo di strumenti innovativi per il monitoraggio di Ae. albopictus tramite due iniziative di “citizen science”. A tal fine sono stati sperimentati due approcci (vedi dettagli nella scheda tecnica P2.1):

1- Il coinvolgimento di 79 studenti universitari (Laurea Magistrale in Medicina e Chirurgia e Laurea Triennale in Tecnico di Laboratorio Biomedico della Sapienza della Sapienza) nel monitoraggio tramite trappole a colla per adulti da maggio a fine luglio 2016. Un’analisi preliminare dei risultati ottenuti sottolineano una buona perfomance degli studenti nelle attività di monitoraggio entomologico ed incoraggiano a perseguire simili iniziative, che hanno come risultato collaterale la sensibilizzazione degli studenti stessi in tematiche relative all’entomologia medica.

2- Il monitoraggio “digitale” tramite ZANZAMAPP, una app per piattaforme Android e iOS (ma scaricabile anche con normale browser su computer, tramite il sito http://web.zanzamapp.it) sviluppata in collaborazione con lo spin-off universitario GH s.r.l. per la parte informatica e di geolocalizzazione ed il gruppo di Social Dynamics del Dipartimento di Fisica della Sapienza, che consente di raccogliere e geo-localizzare immediatamente le segnalazioni degli utenti sulla presenza/assenza di zanzare. ZANZAMAPP è stata lanciata il 6 giugno 2016 con una campagna pubblicitaria curata dall’Ufficio Stampa della Sapienza e con interviste televisive, radiofoniche e su quotidiani e settimanali. Nei primi 140 gg sono state ottenute più di 24.000 segnalazioni su tutto i territorio nazionale. La validità dei dati raccolti verrà validata in base ai dati di monitoraggio di cui al punto 1 e in base ai risultati del monitoraggio entomologico capillare svolto sull’isola di Procida a settembre 2016.

 

P2.2 - Messa a punto di saggi elisa per la valutazione dell’esposizione umana a vettori di arbovirosi (ZANZARE AEDES)

Obbiettivi ed innovatività rispetto allo stato dell’arte: Zanzare Anopheles, Aedes e Culex sono responsabili della trasmissione di agenti patogeni di grande rilevanza per la salute pubblica (parassiti come Plasmodium o arbovirus come Dengue, Chikungunya, Zika o West Nile).

Valutare il grado di esposizione a questi diversi vettori è essenziale per pianificare/implementare adeguate misure anti-vettoriali e stimare il rischio di trasmissione.

Attualmente l’esposizione a culicidi vettori viene valutata con metodiche entomologiche, che tuttavia forniscono stime indirette e sono talvolta difficili da implementare, hanno alti costi, necessitano di personale qualificato e hanno difficoltà logistiche.

Nell’ambito di questo progetto stiamo mettendo a punto saggi immunologici atti a valutare l’esposizione umana a zanzare Aedes (in primis Ae. albopictus ed Ae. aegypti) sfruttando la risposta immunitaria dell’ospite a proteine salivari del vettore (per i dettagli vedi la scheda tecnica P2.2).

Questa linea di ricerca nel I° anno ha incontrato  la difficoltà di reperimento di un adeguato set di sieri umani cosi’ che si è deciso  di iniziare lo screening di proteine/peptidi salivari utilizzando un sistema murino. Si è iniziato quindi il protocollo di immunizzazione degli animali sperimentali.

Selezione dei candidati dai repertori salivari di Ae. albopictus ed Ae. aegypti. Sulla base di precedenti analisi trascrittomiche sono state selezionate una decina di proteine salivari di Ae. albopictus che sono ristrette a culicinae e mostrano percentuali di identità a proteine di Culex ≤ 40% (23.5 kDa, 30.5 kDa, 34k1, 34k2, 62k1, 62k2, HHHa, HHHb, W-rich, Hyp8.2).

È stato anche predisposto un piano di esposizione controllata rispettivamente ad Ae. albopictus, Ae. aegypti ed An. Gambiae (per i dettagli tecnici vedi la scheda tecnica P2.2).

 

P2.3 Quantificazione molecolare del serbatoio infettivo per la trasmissione della malaria dall'uomo al vettore tramite real time QPCR

Plasmodium falciparum, agente eziologico della malaria umana è responsabile di più di 200 milioni di casi clinici e 400.000 decessi ogni anno soltanto nelle regioni Africane. La presenza dello stadio di gametocita di P. falciparum nel sangue periferico è fondamentale per la trasmissione della malaria dall'uomo alla zanzara.

L'identificazione e la quantificazione del parassita malarico nel sangue periferico vengono comunemente effettuate mediante ricerca microscopica diretta, una metodica economica e al tempo stesso molto valida per la diagnosi di routine. Tuttavia, per quantificare il serbatoio gametocitico umano, al fine di valutare il rischio di trasmissione della malaria dall’uomo al vettore, la microscopia diretta si è rivelata non essere uno strumento altrettanto efficace; studi recenti hanno infatti dimostrato che il limite di sensibilità della microscopia (LOD >= 4 parassiti/µl) è inferiore alla densità minima richiesta per l'infezione della zanzara, cioè 1 gametocita/µl.

Un altro aspetto fondamentale per valutare il rischio di trasmissione della malaria è la quantificazione differenziale dei gametociti femminili e maschili per la determinazione della sex-ratio, un parametro importante per il completamento del ciclo del parassita all'interno del vettore.

Obiettivo del progetto è quello di sviluppare saggi in Real Time PCR (SybrGreen) innovativi, economici e più sensibili rispetto al microscopio, per la quantificazione totale e differenziale (rapporto maschi/femmine) del serbatoio gametocitico nell’ospite umano (per i protocolli sperimentali vedi scheda tecnica P2.3).

Nel I anno d’attività, il confronto tra i risultati ottenuti con i saggi molecolari da noi sviluppati e le letture microscopiche ha rivelato, per tutti i marcatori analizzati, una maggiore sensibilità del nostro metodo rispetto al microscopio. Dal punto di vista quantitativo la normalizzazione con il gene endogeno umano 18S ha migliorato la correlazione tra la densità gametocitica stimata al microscopio e quella in  Real Time PCR (coefficiente di correlazione 0,13 vs 0,42).

Altri test,  dettagliati nella scheda tecnica P2.2, sono stati mesi a punto e potranno essere ottimizzati in collaborazione con aziende che operano nel campo delle biotecnologie per permetterne la commercializzazione e quindi l'utilizzo su larga scala.

P2.4  Identificazione di parassiti zoonotici nel pescato e caratterizzazione dei loro antigeni: metodologie innovative

L'Anisakis simplex è un nematode normalmente presente come parassita intestinale in numerosi mammiferi marini (delfini, foche, etc.) ed ospite intermedio, nel suo stadio larvale, di molti pesci di elevato valore commerciale tra cui tonno, salmone, sardina, acciuga, merluzzo, nasello, calamari e sgombro. L'anisakis è estremamente diffuso e presente in più dell'85% delle aringhe, nell'80% delle triglie e nel 70% dei merluzzi.

Il metodo classico di determinazione consiste nella compressione del campione che viene poi osservato in una camera UV da cui si evidenzia la fluorescenza delle larve.

L’EFSA raccomanda di verificare la presenza di Anisakis o delle sue larve nel pescato e nell’uomo al fine di eseguire una mappa della sua distribuzione e delle infezioni anche alla luce del fatto che l’UO ha dimostrato l’esistenza dell’anisakiasi gastro – allergica come una reazione acuta simultanea alla penetrazione del nematode nella mucosa gastrica con risposta immunitaria di tipo th2: attivazione mastociti, eosinofili, reazioni allergiche (angioedema, urticaria).

Cio’ premesso, occorre mettere a punto ed implementare delle metodologie innovative per l’identificazione di parassiti zoonotici nei prodotti ittici preferibilmente attraverso  le metodiche RT-PCR- Multiplex che impiegano primers/probes specie-specifiche.

Dopo prove di validazione dei primers e delle sonde l’identificazione delle larve o dei frammenti in filetti di pesce, si procede alla purificazione del DNA  e all’allestimento di RT-PCR mix così da determinare più specie contemporaneamente. Il test messo a punto dall’UO ha una sensibilità di determinazione del DNA pari a meno di 0,0006 ng/ul,  nessuna cross-reattività ed un’elevata riproducibilità.  

Per cio’ che riguarda gli strumenti innovativi per la valutazione del rischio di allergie nell'uomo da parassiti zoonotici, sono state

-valutate le IgE specifiche attraverso immunocap e testate in parallelo mediante WB

-analizzati e caratterizzati gli antigeni considerati “major allergens” nella specie zoonotica A. pegreffii

Ad oggi, sono stati descritti ed isolati 14 allergeni tra cui Ani s 1, Ani s 7 e Ani s 13, i più importanti rinvenuti nei prodotti escretori/secretori dei nematodi anisakidi che non mostrano alcuna omologia con gli altri allergeni a cui l’uomo è sensibile, sono stati utilizzati nella diagnosi tramite WB. Gli incoraggianti risultati ottenuti sono riassunti nella specifica scheda tecnica P2.4.

 

I2.1 - Metodi per la caratterizzazione epidemiologica di patogeni ospedalieri di provenienza sia ambientale che clinica da utilizzarsi in protocolli di sorveglianza attiva delle infezioni correlate all’assistenza nei reparti a più elevato rischio di infezione

La prevenzione delle Infezioni Correlate all’Assistenza (ICA) è tra le aree prioritarie di intervento individuate dal Piano Sanitario Nazionale che fornisce indicazione di una serie di attività volte al raggiungimento degli obiettivi prefissati.

Tra queste una posizione prioritaria è riservata all’attivazione di un programma per la sorveglianza, la prevenzione ed il controllo delle infezioni nosocomiali. Diventa, pertanto, determinante la messa a punto di un metodo di sorveglianza e controllo delle ICA in quelle aree che sono riconosciute a maggior rischio di infezione.

Il metodo di sorveglianza incentrato sulla triade paziente-ambiente-agente eziologico prevede l’utilizzo di tecniche di epidemiologia molecolare finalizzate alla caratterizzazione fenotipica e genotipica di microrganismi dotati di resistenza ad antibiotici e disinfettanti, all’ isolamento sia clinico che ambientale per prevenire e/o individuare e circoscrivere l’insorgenza di cluster epidemici.

Obiettivo generale. Messa a punto di un protocollo di sorveglianza e controllo delle infezioni nosocomiali da validare, condividere ed esportare nelle strutture considerate ad alto rischio, incentrato sui pazienti e sui microrganismi, di isolamento clinico ed ambientale, la cui identificazione e genotipizzazione consentirà il riconoscimento di cluster epidemici.

Obiettivi specifici. 1) ottenere dati attendibili sull'incidenza delle infezioni nosocomiali; 2) raccogliere dati sull'incidenza e circolazione dei microrganismi MDR e monitorare l’utilizzo degli antibiotici, in modo da studiare l’eventuale correlazione tra pressione selettiva degli antibiotici e diffusione di microrganismi resistenti; 3) genotipizzare i microrganismi responsabili di infezione al fine di stabilire eventuali correlazioni clonali e di quantificare, in tale modo, l’entità delle infezioni crociate.

La metodologia è descritta nella scheda tecnica I1.1.

Risultati. Fase I (novembre 2015 – marzo 2016): completamento e aggiornamento ella letteratura scientifica fino a dicembre 2015; stesura del protocollo della sorveglianza attiva delle infezioni correlate all’assistenza sanitaria; individuazione e contattato un nuovo partner (reparto di Anestesia e Rianimazione Centrale ARC 01, Policlinico Umberto I, Roma); messa a punto il primo protocollo per la genotipizzazione molecolare volto a caratterizzare Klebsiella pneumoniae tramite elettroforesi in campo pulsato.

Fasi II-III (marzo 2016 – settembre 2016): formazione del personale per il protocollo della sorveglianza attiva e per quello della genotipizzazione molecolare di Klebsiella pneumoniae; inizio della sorveglianza attiva in ARC01 come progetto pilota a partire da aprile 2016 con elaborazione puntuale di corrispettivi report mensili.

Complessivamente, nel semestre aprile 2016 – settembre 2016, sono stati ricoverati in reparto 207 pazienti e 190 sono i pazienti entrati in sorveglianza attiva poiché con degenza superiore a 48 ore. I giorni complessivi di ricovero sono stati 2712 di cui: 95% con cateterismo centrale (2568/2712gg); 68% con ventilazione meccanica (1856/2712gg); 99% con cateterismo urinario (2691/2712gg); 7% con derivazione ventricolare (198/2712gg). I pazienti con ICA sono stati 53 mentre 81 sono le diagnosi di infezioni correlate all’assistenza sanitaria di seguito suddivise per tipologia: n. 11 infezioni del torrente ematico correlate a cateteri venosi centrali, n. 18 polmoniti correlate a ventilazione meccanica, n. 23 infezioni delle vie urinarie catetere correlate.; n. 21 infezioni del torrente ematico di origine sconosciuta; n. 4 infezioni del sito chirurgico; n. 4 coliti da Clostridium difficile.

L’incidenza dei pazienti infetti su 100 pazienti a rischio,  l’incidenza delle infezioni del torrente ematico correlate a CVC, l’incidenza delle infezioni rispetto ai giorni di degenza, l’incidenza delle infezioni del torrente ematico di origine sconosciuta, l’incidenza delle polmoniti correlate a 1000 giorni di ventilazione meccanica,  l’incidenza delle infezioni urinarie correlate a 1000 giorni di cateterismo urinario e   le infezioni del sito chirurgico su 1000 giorni di degenza sono riassunte nella scheda tecnica I1.1 unitamente all’ utilizzo degli antibiotici.

Per lo scorso semestre, i maggiori responsabili di infezioni correlate all’assistenza sanitaria sono stati  Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae. Per ciascuno di questi microrganismi è stata effettuata l’analisi del profilo di resistenza agli antibiogrammi e i dati sono riassunti nella scheda tecnica I1.1.

Per quanto riguarda invece il monitoraggio ambientale, ogni monitoraggio include n. 13-20 superfici selezionate (bordo letto, carrello farmaci, monitor, tastiera pc, piano emogas, rubinetto lavabo) per prossimità al paziente, frequenza di utilizzo da parte del personale, rischio di contaminazione e difficile decontaminazione.

I risultati microbiologici descrivono un prevalente riscontro di Acinetobacter baumanni (14 isolati rinvenuti con continuità nel periodo di osservazione) e Klebsiella pneumoniae (5 isolati rinvenuti  rispettivamente nei mesi di aprile n.2, luglio n.2 e un isolato nel mese di agosto.

I risultati riportati nella scheda tecnica descrivono, seppur in un arco temporale limitato, presenza e persistenza nell’ambiente di Microrganismi Alert importanti nell’epidemiologia delle ICA in ARC/01; una maggiore contaminazione del  bordo letto e del carrello farmaci  rispetto alle altre tipologie di superfici indagate come tastiera computer e mouse,  rubinetto lavabo e  emogas come pure  la persistenza di microrganismi su matrici ambientali e l’inefficacia della procedura di sanificazione (considerando il fatto che i monitoraggi sono stati effettuati dopo sanificazione).

 

I2.2 Metodi per la caratterizzazione epidemiologica di patogeni alimentari di provenienza sia alimentare sia clinica da utilizzarsi nel processo di rapid risk assessment  a livello dei punti di ingresso frontalieri

Le tossinfezioni alimentari sono un problema universale. L’incidenza globale è difficile da stimare a causa di sotto-notifiche e sotto-diagnosi attribuibili a uno scarso ricorso ad accertamenti di laboratorio. Inoltre, la trasmissione delle informazioni è spesso poco tempestiva e non permette di condurre tutte le indagini necessarie a stabilire la fonte e le modalità di trasmissione nei tempi appropriati per gestire situazioni a carattere di emergenza.

Obiettivo generale: messa a punto di un modello di comunicazione dei risultati della sorveglianza di laboratorio su microrganismi ricorrenti in notifiche di MAT e in attivazione del RASFF  la cui rapida identificazione, caratterizzazione genotipica e comunicazione sarà di supporto al Rapid Risk Assessment a livello dei Punti di ingresso frontalieri della Regione Lazio.

Risultati: E’ stata eseguita una revisione sistematica della letteratura scientifica. Dopo selezione i patogeni maggiormente riportati sono risultati Salmonella spp  in n. 26 articoli (29%), Escherichia coli tossinogenici in n. 18 articoli (20%) e Listeria monocytogenes in n. 10 articoli (11%). I dati in dettaglio sono riassunti nella scheda tecnica I2.1.

Sono stati altresì attivati contatti con le Autorità competenti (vedi scheda tecnica). Sono state valutate  anche le criticità organizzative-gestionali e tecniche-professionali in tema di gestione delle emergenze correlate agli alimenti sulle quali orientare le attività del progetto Filas per produrre strumenti innovativi da applicare nella Regione Lazio.

Il confronto ha fatto emergere una carenza nei flussi informativi, in particolare nel nodo clinico ospedaliero e territoriale, che ostacolerebbe la gestione dell’emergenza   per ritardo di identificazione dell’agente etiologico e di riconoscimento della comune sorgente di contaminazione e modalità di trasmissione.

Le notifiche prodotte dall’Italia sono state n. 249 (75 alert; 46 border rejection; 128 information) ed i microrganismi patogeni maggiormente coinvolti sono stati: Salmonella spp (n.68), Listeria monocytogenes (n.52) ed E. coli tossigenici (n.31). Le categorie alimentari maggiormente coinvolte nelle notifiche provenienti dall’Italia sono risultate essere molluschi bivalvi e prodotti della pesca con 143 (57%) notifiche, a seguire prodotti carnei e pollame con n. 68 (27%) notifiche, latte e derivati con n. 7 (3%) notifiche, assenti le notifiche per frutta e ortaggi. Sono stati selezionati sin da ora i microrganismi di interesse secondo il criterio di essere indicatori di sicurezza d’uso  “previsti: L. monocytogenes, E. coli” e “non previsti: Y. enterocolitica” nei Regolamenti Comunitari [Reg.to (CE) n. 2073/2005 e Reg.to (CE) n.1441/2007)] da acquisire in collaborazione con l’ IZSLT e ISS.

Gli ulteriori obiettivi raggiunto nel I anno sono anch’essi riassunti nella scheda tecnica I1.2.